🧬 普康智合 · qPCR 引物分析工具

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📖 使用说明

📊 批量分析

每行输入一条 DNA 引物序列（支持 FASTA 格式），实时计算：

• Tm — 解链温度，基于 SantaLucia 1998 最近邻法
• GC% — GC 含量百分比，推荐 40-60%
• 发卡 ΔG — 发卡结构自由能，< -3 kcal/mol 需注意
• 自二聚体 ΔG — 自身互补形成二聚体的风险
• 引物间二聚体矩阵 — 多条引物之间的交叉二聚体风险热力图

点击每行结果的「详情」可查看完整的二级结构分析。

🧪 扩增模拟

输入正向引物、反向引物和模板序列，进行 In-Silico PCR：

• 自动定位引物在模板上的结合位点
• 彩色高亮显示扩增区域（正向引物/反向引物/扩增子/探针）
• 4-PL 模型模拟 qPCR 扩增曲线
• 根据模板浓度预测 Ct 值

🤖 智能设计

输入目标 DNA 序列，自动设计最优引物对：

• 基于 Primer3 罚分算法筛选候选引物
• 自动配对，优先选择 Tm 差异 ≤2°C 的组合
• 支持设置 Tm 范围、扩增子长度、Mg²⁺ 浓度
• 输出 Top 10 方案，按综合评分排序

🔬 综合分析（V2 新增）

输入正向引物 (FYW) 和反向引物 (RYW)，一键生成完整分析报告：

• 基本参数 — Tm、GC%、长度、ΔG₃₇、3' 端稳定性
• Tm 差异分析 — F/R 引物 Tm 差异评估
• 自二聚体 — 各引物自身二聚体检测 + ASCII 结构图
• 异源二聚体 — F+R 引物间二聚体检测，区分 PCR 特异性和非特异性
• 发卡结构 — 茎环结构检测 + ASCII 结构图
• 互补碱基分析 — 最长连续互补序列、重叠互补率
• 特异性评估 — 引物特异性评分
• 综合评分 — 0-100 分，综合所有指标的加权评分

🎯 探针设计（V2 新增）

输入引物对和模板序列，自动设计 qPCR 探针：

• TaqMan 水解探针 — 长度 18-30bp，Tm 比引物高 5-10°C
• MGB 短探针 — 长度 13-25bp，MGB 修饰提升 Tm +12-15°C
• 自动规避 5' 端 G（G-quenching 效应）
• 探针位于正向引物和反向引物之间
• 按综合评分排序，输出 Top 10 候选探针

🔧 核心算法

Tm 计算

SantaLucia 1998 最近邻法（Nearest-Neighbor）：

Tm = ΔH / (ΔS + R × ln(Ct/4)) - 273.15 + 盐浓度校正

支持 Owczarzy 2008 Mg²⁺ 浓度校正。

ΔG 自由能参数（SantaLucia 1998）

从引物设计大师软件二进制中提取验证的标准参数表：

• AA/TT: -1.00 | AT/TA: -0.88 | TA/AT: -0.58
• CA/GT: -1.45 | GT/CA: -1.44 | CT/GA: -1.28
• GA/CT: -1.30 | CG/GC: -2.17 | GC/CG: -2.24
• GG/CC: -1.84（单位: kcal/mol）

二聚体检测

遍历所有偏移位的互补匹配，基于 nearest-neighbor Tm 评估风险。GC-rich 短匹配可能比 AT-rich 长匹配更危险。区分 PCR 特异性二聚体（3' 端参与）和非特异性二聚体。

发卡结构检测

搜索所有可能的茎环结构（茎 ≥3bp，环 ≥3nt），计算茎区 ΔG，取最稳定结构。

MGB 探针 Tm 修正

MGB（Minor Groove Binder）修饰使短探针 Tm 显著提升。修正值基于探针长度和 GC%，范围 +12~15°C。

📋 使用建议

• 引物长度推荐 18-25bp，Tm 推荐 55-65°C
• GC% 推荐 40-60%，避免 poly-N（≥4 个连续相同碱基）
• F/R 引物 Tm 差异 ≤2°C 为优秀，≤5°C 可接受
• 发卡 ΔG > -3 kcal/mol，二聚体 ΔG > -5 kcal/mol 为安全
• 3' 端最后 5 个碱基中 G/C ≤3 个，避免非特异性延伸
• TaqMan 探针 Tm 应比引物高 5-10°C

V2.0 — 基于 SantaLucia 1998 热力学模型 | 离线可用 | 单文件 HTML